Dag 2

Dag 2

Idag har du utfört en PCR.

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Resultatet blev bra.

Markören vi använde var markör IX. Vi placerade den i mitten av de fem brunnar vi använde och banden framtädde tydligt så att vi på ett bra sätt kunde uppskatta antalet baspar (bp) i de band som förekom i kontrollerna och provet vi undersökte med gelelektroforesen. 

I gelen visades den negativa kontrollen från PCR som ett tunt smear över hela kolumnen. Eftersom inga band förekom har kontaminering under förberedelserna för PCR inte uppståt. Eventuella proteiner som av misstag kommit med inför PCR skulle där ha mångfaldigats och gett ett klart band i gelen. 

Den positiva PCR-kontrollen visade starkt positivt resultat för molekyler om ca 550bp. Detta var det förväntade resultatet eftersom LL37genen tillsatts till kontrollen och LL37genen är ca 550 bp lång. I samma kolumn fanns även ett band på ca 1600 bp. Detta är resterna från plasmiden innehållande LL37 som tillsattes i positiva kontrollen.

I brunnen där vi tillsatte vårt prov bestående av plasmid som genomgått PCR visades ett tjockt band bestående av PCR-produkter om 550 bp. Det visade att LL37genen amplifierats under PCR!

I den sista brunnen fanns plasmidprepen innehållande 0,5 ug plasmid. Här bildades ett band ungefär på mitten av gelen och det visade att det fanns plasmid i lösningen. Band som bildats högre upp, strax under brunnen, skulle ha visat på kromosomalt DNA. RNA skulle ha gett tunna band längst ner i gelen. För plasmidprepen kan inte storleken bestämmas med hjälp av  markören. Det beror på att plasmiderna kan gå sönder i sin ena ring vilket förstör strukturen och den blir till en open cirkel. Plasmiden kommer då att vandra långsammar i gelen på grund av sin formförändring. Så trots att den har samma antal bp kommer ett band att bildas högre upp.

 

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Nej

Dag 1

Dag 1

Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.

Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Proteiner, celldelar/cellrester, kromosomalt DNA, RNA.

Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Genom att undersöka plasidlösningens absorbans (A) vid olika våglängder kan DNAkoncentration och kontaminering av protein i lösningen beräknas.

A 260nm: 0,074

A 280nm: 0,042

Kvoten A260/A280 = 1,76

Kvoter under 1,8 indikerar kontamination av protein. Värden mellan 1,6 - 2,0 är acceptabla och jag är nöjd med mitt resultat trots att plasmiden alltså inte är helt ren.

Så svaret blir nej, inte helt ren plasmid. Men så gott som!

Koncentrationen av DNA beräknades också av absorbansen vid 260nm och vi bevisade att det faktist finns plasmid i lösningen.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Om vi hade haft högre kontaminering av protein och inte varit nöjda med reningen, skulle vi då ha kunnat rena om plasmiden på något sätt eller är det bara att kasta och börja om?

Hur stor är sannolikheten att vi laboranter har kontaminerat plasmidlösningen, att protein kommer utifrån och inte är gamla celldelar som inte renades bort? Skulle det i så fall visa sig i absorbansmätningen? Eller blir det för små mängder?

Tjo blogger here we go...